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Precellys Evolution—蛋白质样本制备理想方案

发布时间:2020-11-02浏览:145次

 

蛋白质是生命的基石,它们几乎在地球的每一种生物中都能被找到,对我们的生存很重要。一些蛋白质例如抗体、酶、激素等会参与化学反应免疫过程以及细胞活动。蛋白质还在运动、结构支持、存储能量、细胞消化、底物运输等方面起作用。蛋白质由长链氨基酸组成,形成多种多样,不同形状大小的蛋白质。蛋白质因为其不同的长链氨基酸组成,每一种类型都有稳定特别的三维结构。这种特殊的结构是至关重要的,每一个形状的改变都会引起蛋白质功能的变化。所以说像蛋白质这种对热敏感的分子,在分子下游分析过程之前的样品制备就显得格外重要。Precellys Evolution结合Cryolys Evolution冷却系统能够有效的在研磨过程中使研磨腔室温度稳定保持在4℃。

 

使用Precellys提高组织蛋白质的提取量

 

APPNOTE 1:从大鼠皮肤组织提取蛋白质沉淀和脂肪

APPNOTE 2:使用Minilys从小鼠心脏组织从提取蛋白质

Protocol 1:大体积大肠杆菌中提取蛋白质

Protocol 2: 96通道眼睛组织中提取蛋白质

 

APPNOTE 1

从完全匀质的大鼠皮肤组织中提取蛋白质沉淀和脂肪

 

本应用中研究了从大鼠皮肤组织中提取蛋白质沉淀和有生物活性的脂肪。本应用中利用固相萃取与液相色谱质谱联用技术(LC-MS/MS)来测组织中脂肪含量。大鼠皮肤组织使用Precellys Evolution生物样品研磨器和Cryolys冷却系统进行研磨,配合7mlCKMix50_研磨管。此外还测试了在大鼠组织整个研磨的过程结束后,样本温度都在40℃以下。

 

实验材料

自动研磨器:Precellys Evolution生物样品研磨器和Cryolys冷却系统;

研磨管:CKMix50_7ml(Cat #: KT03961-1-306.7);

组织样本:大鼠皮肤组织(后足背侧和腹侧);

干冰;

Buffer:甲醇。

 

实验方法

20-90mg成年大鼠皮肤组织(后足背侧和腹侧),7ml研磨管加2.8mm和5.0mm陶瓷珠,500µL甲醇;转速8000rpm,5个循环,每个循环10s,循环之间间歇120s;Cryolys冷却系统将腔室内温度降至5℃时开始研磨;研磨结束之后立即使用温度探针检测样本管内的温度。

 

实验结果

如下图1、2所示,图1中a、b分别为研磨前与研磨后效果对比,结果显示皮肤样本被充分研磨;图2为样本被匀质后经过固相萃取,用LC-MS/MS技术检测,成功检测到花生四烯酸,5-HETE、8-HETE、9-HETE的浓度分别为1.3 ±0.3、7.9±0.6和1.3 ± 0.4 ng/mg。

 

 

 

 

实验结论

大鼠的后爪皮肤比背部皮肤厚,因此获得其完整匀质的难度更大,使用Precellys Evolution生物样品研磨器,结合Precellys裂解试剂盒成功研磨大鼠后爪皮肤组织。本应用同样也展示了Cryolys冷却系统能够保证样本温度在40℃以下。

 

APPNOTE 2

使用Minilys从小鼠心脏组织中提取蛋白质

 

开曼化学研究和生产抗体,为了营造更好的研究市场。为了保证质量,需要合适的组织裂解产物来确保我们的产品达到或者超过我们质量控制的标准。我们很多目标蛋白都是多通道跨膜受体,因此需要一个非常强力的裂解系统。

 

实验材料

Minilys生物样品研磨器;CKMix 2mL (KT03961-1-009.2)研磨管;920mg小鼠心脏组织;裂解Buffer:920µL M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent, Pierce)。

 

实验方法

Minilys研磨参数:研磨速率5000rpm;4个循环,每个循环20s,循环之间间歇5s;

分析方法:使用Minilys研磨样本之后,从中提取细胞质和膜蛋白;HEK 293细胞(S1P3转染和未转染)在细胞培养板上培养,随后提取蛋白质;所有的蛋白通过BCA法测定,溶菌产物通过Western Blot分析。

 

结果如图所示:图1为使用S1P3多克隆抗体;一列为3µLMark,第二列为2.5μgS1P3转染过的HEK293细胞裂解产物,第三列为5μgS1P3转染过的HEK293细胞裂解产物,第4列为50μg小鼠心脏膜蛋白裂解产物。结果显示均有很好的条带,研磨提取效果好。图2为使用一种视神经多克隆抗体(C-Terminal);一列为3µLMark,第二列为60μgHEK293细胞裂解产物,第三列为40μgHEK293细胞裂解产物,第四列为50μg小鼠心脏细胞质裂解产物,第五列为小鼠心脏膜蛋白裂解产物,结果显示均有很好条带,研磨提取效果好。

 

实验结论

Minilys生物样品研磨器结构紧凑,使用方便,Minilys提供了更纯净、更浓缩的裂解产物,对目标蛋白分析有很高的重复性。Minilys可同时研磨3个样本,可用2ml或0.5ml研磨管,是低通量实验的理想选择。

 

Protocol 1

大体积大肠杆菌中提取蛋白质方案

 

 

研磨管:7ml VKMix_或15mlVK05_

样本量:5ml或10ml(OD600下为50)

研磨参数:7ml:转速9000rpm,6个循环,每个循环30s,循环间歇60s;15ml:转速9900rpm,6个循环,每个循环60s,循环间歇60s

 

Protocol 2

96通道从眼组织中提取蛋白质

 

 

 

研磨管:CKMix_WP

样本:视网膜神经或眼杯

Buffer:50µL M-PER

研磨参数:视网膜:转速5500rpm,3个循环,每个循环30s,循环间歇30s;眼杯:转速8200rpm,3个循环,每个循环30s,循环间歇30s。

 

 

Precellys生物样品研磨器:

超快速: up to 10 000 rpm

超灵活: 0.5, 2, 7和 15mL研磨管

超高效: 强力3D振动

超保护: Cryolys Evolution新型冷却技术,无需液氮和压缩空气

 

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